Dzisiaj porozmawiajmy o problemie, który spowodował niezliczone kolegów badawczych - eksperyment Western blot (WB). Ten pozornie prosty, ale pełen eksperymentu „pułapek”, dlaczego zawsze sprawia, że potykamy się wielokrotnie? Teraz przejrzyjmy przyczyny niepowodzeń razem.
I. Brak zespołów
Możliwe przyczyny mogą obejmować:
- Problemy przeciwciał: Przeciwciało może być nieskuteczne, niespecyficzne lub nie wiążą się z docelowym białkiem.
- Problemy z próbką: Próbka może zawierać substancje zakłócające, być zbyt niskie w stężeniu lub już zdegradowano.
- Problemy z elektroforezą: niewłaściwe warunki elektroforezy, takie jak napięcie, czas lub niewłaściwe stosowanie buforu.
- Problemy z transferem: Problemy podczas procesu transferu, takie jak niewłaściwy wybór membrany, czas transferu lub bufor transferowy.
- Problemy z blokowaniem: Rozwiązanie blokujące może być nieodpowiednie lub czas blokowania może być zbyt długi.
- Problemy z barwieniem: Odczynnik barwienia może być wygasł, niewrażliwy lub niewłaściwie stosowany.
Problemy ze sprzętem: sprzęt może nieprawidłowo działać lub nie być odpowiednio skalibrowane.
- Problemy z działaniem eksperymentalnym: Eksperymentalne działanie nie może być znormalizowane, takie jak niewystarczające mycie lub nierówne obciążenie próbki.
- Problemy z modyfikacją białka: Białko docelowe może poddawać się modyfikacjom potranslacyjnym, które zapobiegają rozpoznawaniu przeciwciał.
- Problemy z ekspresją białka docelowego: Białko docelowe może mieć bardzo niską ekspresję lub brak ekspresji w wykrywanych komórkach lub tkankach.
Ii. Wysokie tło
Możliwe przyczyny mogą obejmować:
- Wysokie stężenie przeciwciała: stosowanie zbyt dużej ilości przeciwciał może zwiększyć wiązanie niespecyficzne, co powoduje wysokie tło.
- Problemy z jakością przeciwciał: Przeciwciało może mieć duże niespecyficzne wiązanie lub reakcja krzyżowa z innymi białkami.
- Niewystarczające blokowanie: Rozwiązanie blokujące nie obejmuje skutecznego pokrycia niespecyficznych miejsc wiązania na błonie, co powoduje wysokie tło.
- Problemy z błoną: membrana może mieć niską jakość lub zanieczyszczenie, co prowadzi do wysokiego tła.
- Niekompletne przeniesienie: Podczas procesu przenoszenia białka nie mogą być w pełni przeniesione na błonę, co powoduje wysokie tło.
- Niewystarczające mycie: Kroki mycia nie usuwają skutecznego usuwania niezwiązanego przeciwciała lub innych zanieczyszczeń, co prowadzi do wysokiego tła.
- Problemy z barwieniem: odczynnik barwienia może być zbyt wrażliwy lub niestabilny, co powoduje wysokie tło.
- Problemy z wyposażeniem eksperymentalnym: Sprzęt może mieć wyciek lub zakłócenia, co prowadzi do wysokiego tła.
- Problemy z próbką białka: próbka może zawierać dużą ilość substancji zakłócających, takich jak produkty do degradacji białka lub inne zanieczyszczenia.
- Problemy z działaniem eksperymentalnym: Eksperymentalna operacja może nie być znormalizowana, taka jak przedłużony czas inkubacji lub wysoka temperatura.
Iii. Niespecyficzne pasma lub niepoprawne rozmiary pasm białkowych
Możliwe przyczyny mogą obejmować:
- Zbyt wiele fragmentów komórek, co powoduje różne poziomy ekspresji białka, co prowadzi do niespójnych rozmiarów pasm lub obecności wielu pasm.
- Degradacja próbki białka, powodując niższą masę cząsteczkową białka lub obecność wielu pasm.
- Próbki białek ekspresyjnych in vivo mogą mieć różne formy modyfikacji, takie jak acetylacja, metylacja, alkilacja, fosforylacja i glikozylacja, prowadząc do niespójnych rozmiarów pasm lub obecności wielu pasm.
- Białko docelowe zawiera wiele izoform lub wariantów splicących, co powoduje niespójne rozmiary pasm lub obecność wielu pasm.
